發(fā)光細菌暗變種檢測環(huán)境樣品致突變性
摘要:顧宗濂于1993年首次在國內報道利用自行分離到的明亮發(fā)光桿菌的自發(fā)暗變種T9171菌株，測試五種遺傳毒物的致突性，指出暗變種對化合物致突變效應的靈敏度高于Ames試驗，發(fā)光細菌暗變種試驗可望成為一種簡易靈敏的生物致突變性測試方法。本文對發(fā)光細菌暗變種的檢測原理、測試方法和應用研究作簡要介紹，并與Ames試驗進行比較，以推進暗變種方法在我國環(huán)境監(jiān)測中的研究和應用。
關鍵詞： 細菌;檢測;環(huán)境樣品;致突變性
1. 檢測原理
對發(fā)光細菌經(jīng)過理化方法誘變處理后，使其失去發(fā)光能力或發(fā)光強度極弱，稱為暗變種（K. variant）。若暗變種接觸致突變物，在世代分裂時可導致突變，恢復一定程度的發(fā)光能力。利用暗變種恢復發(fā)光的現(xiàn)象，可對各種遺傳毒物或環(huán)境樣品進行篩選、檢測。這可能是由于致突變物使調節(jié)基因發(fā)生突變，使其不能產(chǎn)生或產(chǎn)生無活性的抑制物質，也可能使DNA雙鏈發(fā)生構象改變，使抑制物質不能與之結合而失去抑制效應，總之，真正的回復突變機理目前還不清楚。
2. 測試方法
AZUR 公司采用費氏弧菌Vibrio fischeri 的暗變種M 169，制成凍干粉于-20℃保存，測定前復蘇，在27-30℃與待測物接觸16，20，24小時或更長時間以后檢測發(fā)光強度，同時做陰性和陽性對照。一般規(guī)定，對某一化合物的所有測試濃度，若樣品發(fā)光比陰性對照發(fā)光≤2，則認為該化合物無致突變性；若樣品的發(fā)光為陰性對照的至少2倍，則認為反應陽性，至少連續(xù)2個濃度為陽性才能確定為有致突變性。
顧宗濂在研究初期采用暗變種的新鮮培養(yǎng)液，20℃環(huán)境中待測物與培養(yǎng)液在測定管中靜止培養(yǎng)，于0，14小時以后每隔4小時測發(fā)光強度，至各管發(fā)光強度達最大值后明顯下降為止。若樣品的最大發(fā)光值為同一時間空白對照的至少2倍，則認為反應陽性。1999年謝思琴、顧宗濂等報道了采用4℃保存的暗變種凍干粉，20℃振蕩復蘇，與待測化合物接觸振蕩培養(yǎng)24小時后每隔3-4小時測定一次發(fā)光強度。以樣品發(fā)光強度為空白對照的3倍者為陽性效應，若樣品的5個平行系列中有3個陽性效應，即認為該樣品具有致突變性；若樣品的平行系列中陽性效應數(shù)不足3個，則認為陽性可疑。
3. Mutatox與Ames試驗的方法比較
Mutatox與Ames試驗屬于體外致突變性檢測方法，都是細菌法，使用大鼠肝臟提取液S9作為代謝活化因子。Mutatox與Ames試驗相比具有快速、簡便等特點，具體從以下幾點加以討論：
(1) Mutatox試驗中使用的發(fā)光細菌暗變種是從AZUR 公司購買的真空包裝凍干粉，-20℃保存，測試菌株不需要進行預試驗，復蘇凍干粉即可用于試驗。Ames試驗中菌液準備工作量大。冷凍保存的菌種先進行增菌培養(yǎng)，然后進行菌株生物學性狀的鑒定，若生長及生物學性狀不符合要求，應對其進行劃線分離。此外還要進行例如各種培養(yǎng)基、營養(yǎng)液的準備和滅菌等準備工作。
(2) Mutatox試驗不需要嚴格的無菌條件。一般情況下Mutatox測試不受環(huán)境中存在的非發(fā)光細菌的影響，只有當雜菌的濃度過大（約大于105/mL）時才需要用0.22μm的膜進行過濾。同時，Mutatox測試介質含有高濃度鹽、低濃度營養(yǎng)液和一些廣譜性抗菌素，相對高濃度測試菌株的加入，以及測試終點的檢測特點，大大降低了可能進入測試系統(tǒng)的雜菌對測試結果的影響。Ames試驗需要進行嚴格的無菌操作，對工作人員的微生物實驗技能要求較高。因為雜菌的存在會嚴重影響平皿滲入法計算回變菌落數(shù)。
(3) Mutatox方法不需要繁瑣且昂貴的連續(xù)培養(yǎng)，批量生產(chǎn)的凍干粉保證了其品質的穩(wěn)定性，并能減小其遺傳變異。試驗一般只需要24小時即可完成，操作簡便、花費低。Ames試驗一般需要48-72小時完成，要配制多種培養(yǎng)基，所需材料多、費用高、費時較多。
(4)為了使Mutatox方法標準化，已經(jīng)有大量的工作比較了Mutatox方法與Ames試驗對單一化合物和環(huán)境樣品致突變性檢測的靈敏度和準確性。Johnson B.T. 對8種典型致突變前體物的檢測結果證明，Mutatox方法和Ames試驗在定性和定量兩方面的靈敏度相近，Mutatox方法可成為檢測復雜環(huán)境中致突變物質的一個有效的監(jiān)測手段。謝思琴、顧宗濂等對發(fā)光細菌暗變種T9171的靈敏度進行了研究，結果充分說明T9171試驗與Ames試驗檢測遺傳毒物所反映的遺傳毒性水平具有較好的一致性。
4．應用
近年來，科學工作者已經(jīng)用發(fā)光細菌暗變種檢測出100多種單一化合物的致突變性，同時也用于檢測各種環(huán)境樣品的致突變性。Kwan等用Mutatox方法測試了河水和沉積物的有機提取物的致突變性，同時檢測了其急性和慢性毒性，證明Mutatox是成組試驗（battery of tests）中有用的方法。Békaert等利用Ames和Mutatox試驗、活體兩棲動物微核試驗對被PAHs和重金屬污染的土壤浸出液進行致突變性檢測，通過非過濾樣品和過濾樣品的比較試驗，指出Mutatox試驗中樣品不經(jīng)過0.45μm膜過濾能更準確地檢出顆粒物上吸附的生物活性污染物的致突變性。
此外，Johnson用Mutatox和Microtox方法測定了50多種農藥、致突變劑和工業(yè)污染物，Mutatox方法對各種化合物的敏感性與文獻報道的Ames實驗結果相一致，統(tǒng)計分析結果表明急性毒性和致突變性之間存在著明顯的相關性（p<0.05），并利用這兩種方法測試了8個有機沉積提取物。
1993年以來，我國學者利用明亮發(fā)光桿菌的自發(fā)暗變種T9171進行了一些研究工作。首先研究了T9171暗變種對5種已知的致突變劑的回復突變效應，利用所建立的實驗方法檢測了工業(yè)廢渣的致突變效應，結果與Ames試驗結果的趨勢相似。將暗變種T9171制成凍干粉，采用改進的實驗方法研究了36種有機化合物的致突變效應，并與Ames試驗比較，以一致陽性的受試物最低劑量進行相關分析，在0.01的顯著性水平上兩種方法的吻合率達69%。趙華清等將此方法應用于環(huán)境樣品中，檢測了14種環(huán)境水樣和9種化合物的基因毒性，結果說明加S9能大大提高發(fā)光細菌暗變種的檢測靈敏度。
Mutatox方法在國際上已經(jīng)得到了一定程度的應用，但是由于凍干粉價格相對較高，很難在我國推廣。我國學者自行分離出暗變種T9171，并進行了初步的研究，但該法的測定步驟及其判斷標準還有待于進一步完善。隨著簡便、快速、經(jīng)濟的發(fā)光細菌暗變種測試方法的逐步成熟，并與其它化學和生物測試方法聯(lián)合，應用前景將會非常廣闊。
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