飲用水安全評價指標(biāo)——Vero細(xì)胞培養(yǎng)法
飲用水安全是一個國家和地區(qū)發(fā)展水平和生活質(zhì)量的重要標(biāo)志，而我國不僅人均水資源擁有量只有世界平均水平的四分之一，而且隨著經(jīng)濟(jì)建設(shè)的快速發(fā)展，水污染形勢依然嚴(yán)峻，越來越多的化學(xué)物質(zhì)在生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用過程中將不可避免地進(jìn)入飲用水源，而各種新材料在飲用水行業(yè)的使用也可能造成其中微量化學(xué)物質(zhì)的溶出，這些因素使得目前飲用水中化學(xué)物質(zhì)種類不斷增多，對人體健康和生態(tài)環(huán)境造成了日益嚴(yán)重的危害，因此，其安全評價具有重要意義。
由于飲用水中化學(xué)物質(zhì)具有種類繁多，濃度極低的特點(diǎn)，單一的理化指標(biāo)無法反映水體中各類物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)。傳統(tǒng)的生物試驗法，如魚類試驗和蚤類試驗，因靈敏度較低，達(dá)不到檢測痕量化學(xué)物質(zhì)的要求。近年來興起的一些基于分子水平和細(xì)胞水平的方法，如發(fā)光細(xì)菌法和遺傳毒性法，被廣泛用于飲用水及相關(guān)材料(浸泡液)毒性物質(zhì)的檢測。本文根據(jù)有關(guān)材料系統(tǒng)介紹了現(xiàn)有飲用水及相關(guān)材料安全評價技術(shù)的原理、過程和應(yīng)用，分析了各種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)和不足，提出發(fā)展依據(jù)細(xì)胞形態(tài)變化的Vero細(xì)胞培養(yǎng)法——一種生物安全評價技術(shù)的原理、過程和應(yīng)用，以為大家提供一種廣譜、可靠、靈敏、簡單易行的綜合測試技術(shù)。
盡管儀器法的發(fā)展使飲用水中微量物質(zhì)的檢測變得更加方便、快速，但檢測成本偏高，并且由于水中各種化學(xué)物質(zhì)之間的協(xié)同作用，單一的理化指標(biāo)無法反映飲用水的綜合毒性。傳統(tǒng)的生物試驗法(如魚類、藻類試驗法)可以檢測水體的長期和綜合毒性，但其靈敏度較低、所需時問長，不適于飲用水的安全評價。從20世紀(jì)80年代以來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物體(特別是微生物)中一些分子與細(xì)胞水平的變化被用作衡量水體安全的指標(biāo)，并以此為基礎(chǔ)建立了一些快速、靈敏的檢測和評價水體生物毒性的技術(shù)。
Vero細(xì)胞培養(yǎng)法英國于20世紀(jì)90年代，逐步發(fā)展和完善了一種細(xì)胞毒性檢測法——Vero細(xì)胞培養(yǎng)法，以用于飲用水及相關(guān)材料的綜合安全評價。該法的原理是利用來源于非洲綠猴腎臟的Vero細(xì)胞(CCL一81)在正常情況下生長時，呈不規(guī)則三角形狀；而在含一定濃度有害化學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長時，則由三角形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形的特點(diǎn)來判斷飲用水及相關(guān)材料的綜合安全性(材料的安全性評價通過測定材料浸泡液的綜合生物毒性進(jìn)行)。
Romem用Veto細(xì)胞測試氯化汞的毒性，并確定了能夠檢測到毒性的氯化汞的濃度范圍。Fernandez采用Vero細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析和生化分析確定了五氯苯酚對哺乳動物細(xì)胞的毒性已有研究表明，很低濃度的有害化學(xué)物質(zhì)就可造成Vero細(xì)胞變形(高濃度造成細(xì)胞死亡或繁衍速度下降)，因此，其反應(yīng)靈敏度極高，而且對不同性質(zhì)化學(xué)物的反應(yīng)具有普遍適用性(重金屬離子、極性與非極性有機(jī)物的超標(biāo)都可造成細(xì)胞變形)。同時，非洲綠猴腎臟的Vero細(xì)胞與人體細(xì)胞高度同源，檢測時間僅需48h因此，該方法是一種理想的飲用水綜合安全評價手段。
Vero細(xì)胞變形試驗可分為三個階段，(1)在實驗條件下建立和維持Vero細(xì)胞系生長；(2)將受試水樣或飲用水相關(guān)材料的浸提液配制一批細(xì)胞培養(yǎng)基；(3)進(jìn)行受試樣品的細(xì)胞毒性試驗，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。(1)試驗水(Testwater)必須是不含有余氯的，這樣以免對細(xì)胞系的生長產(chǎn)生毒害和抑制；(2)試驗材料(testsample)需要用試驗水清洗10min，去處其表面的雜質(zhì)，以免對試驗結(jié)果造成影響；(3)將清洗過的一定表面積的試驗材料放人試驗容器(Testcontainer)中，用試驗水在23℃避光條件下浸泡24h；(4)進(jìn)行材料浸泡液的Vero細(xì)胞毒性試驗——配制含有不同劑量浸提液的培養(yǎng)基，準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液，接種到培養(yǎng)皿中的細(xì)胞濃度在l03—105個/m2，以確保細(xì)胞對污染物較高的靈敏度，在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24～48h，然后在低倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；(5)如果培養(yǎng)皿表面能形成一個相互融合的、生長良好的細(xì)胞單層，則說明材料浸提液對細(xì)胞無毒性反應(yīng)，實驗結(jié)束；(6)如果材料浸提液對細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生了影響(細(xì)胞變圓、無細(xì)胞單層)，那么應(yīng)該對另外兩個平行樣再進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗；(7)如果在兩平行樣的毒性試驗中，都能形成一個相互融合的、生長良好的細(xì)胞單層，則說明材料浸提液對細(xì)胞不產(chǎn)生毒性反應(yīng)，實驗結(jié)束；(8)如果另兩平行樣品中仍有一個對細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了影響(細(xì)胞變圓、無貼壁的細(xì)胞單層)，則說明材料浸提液對細(xì)胞產(chǎn)生毒性反應(yīng)，實驗結(jié)束。
他們考察了2，4，6一三氯苯酚(TCP)和飲用水相關(guān)材料(PVC管和一次性塑料水杯)的浸泡液致Vero細(xì)胞變形的靈敏度與相關(guān)性，并與四氮甲唑藍(lán)(MTF)比色法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：TCP對Vero細(xì)胞的毒性響應(yīng)濃度為0.5mg／L，且變形細(xì)胞的比例與TCP濃度呈正相關(guān)，而MTY比色法測定低濃度TCP(<1.0mg/L)致Vero細(xì)胞增殖抑制率的結(jié)果不穩(wěn)定；流式細(xì)胞儀AN—NEXINV—FITC／PI雙染色法的檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞膜損傷是Vero細(xì)胞毒性的早期表現(xiàn)特征，比細(xì)胞凋亡和壞死更靈敏；Vero細(xì)胞暴露于飲用水相關(guān)材料的浸泡液時，其變形細(xì)胞的比例隨浸泡溫度的升高而增加，而在相同條件下，MTF比色法測定的浸泡液對Vero細(xì)胞的增殖抑制率則呈現(xiàn)不規(guī)律變化。
他們以2,4，6一三氯苯酚(2，4，6一trichlorophenol，TCP)為例，采用MTF比色實驗和ANNEXIN V—FITC／PI雙染色一流式細(xì)胞技術(shù)研究了Vero細(xì)胞對有機(jī)化學(xué)污染物的毒性響應(yīng)特征和敏感性，以期發(fā)現(xiàn)一種靈敏、可靠的表征微量化學(xué)物質(zhì)綜合毒性的方法．研究結(jié)果表明：1)TCP濃度對Vero細(xì)胞的毒性響應(yīng)特征有決定作用。低濃度TCP(≤0．5mg·L-)即可使部分細(xì)胞從原有的剛性不規(guī)則三角形結(jié)構(gòu)變?yōu)閳A形或橢圓形，但細(xì)胞的生長未受明顯抑制．TCP濃度在1～5mg·L-時，細(xì)胞生長開始受到抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖受到抑制及部分細(xì)胞凋亡或死亡，但增殖抑制率和TCP濃度之間的關(guān)系不明顯．當(dāng)TCP濃度大于5mg·L-時，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，且隨TCP濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高．2)TCP作用時間對Vero細(xì)胞的毒性響應(yīng)特征有顯著影響。ANNEXIN V—FITC／PI雙染色一流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，TCP作用24h內(nèi)Vero細(xì)胞毒性表現(xiàn)為以細(xì)胞膜的完整性受到損傷為主，凋亡或壞死細(xì)胞比例較小；而48h后，凋亡細(xì)胞的比例明顯增加．細(xì)胞復(fù)壯實驗結(jié)果進(jìn)一步證實24h內(nèi)形態(tài)發(fā)生變化的細(xì)胞并未完全壞死或凋亡。以上結(jié)果表明細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞膜損傷均為細(xì)胞毒性的早期表現(xiàn)特征，兩者之間可能存在某種相關(guān)性，以此表征化學(xué)污染物的生物毒性具有較高的靈敏度，值得進(jìn)一步研究。
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